原代細胞在相關細胞實驗使用過程中越來越多，人們不再單單趨于使用細胞系進行實驗研究，因為細胞系常常由于體外長期培養(yǎng)，而容易丟失原有的生物學特性，對藥物處理的反應差距越來越大。

        原代細胞剛從組織中分離開，生物學特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也接近和反應體內生長特性，原代細胞的活力和生長狀態(tài)都比較好，細胞的純度和基因保留可達到 90% 以上，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等試驗研究，使用原代細胞進行實驗，可以獲得更準確的研究和數據。

         為了更好的服務于廣大科研工作者，遠慕生物技術人員特提供了角質形成細胞分離的常用方法，技術因人而異僅供參考：

         角質形成細胞是一種不斷分化的復層鱗狀上皮細胞，其分化的終階是形成角蛋白。根據角質形成細胞的發(fā)展階段和特點，從內向外可將其分為五層?；准毎麑佑址Q生發(fā)層，棘細胞層，顆粒層，透明層，角質層。

         角質形成細胞的分化成熟表現為從基底層到向角質層的逐漸移行。在單一移行過程中，角質形成;細胞的形狀和功能也逐漸發(fā)生著變化，從單層柱狀上皮的基底層到扁平的細胞核消失的角質層。新生的基底細胞進入棘細胞層，然后上移到顆粒層的上層。細胞組織來源于實驗動物的正常皮膚組織，細胞生長狀態(tài)為貼壁培養(yǎng)。

需要的實驗試劑：
1.培養(yǎng)基 1：iCell 原代角質細胞培養(yǎng)體系
4.基礎培養(yǎng)基：DMEM/F12
5.緩沖液：無菌不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 1×PBS+1×P/S，pH=7.4
6.消化液 1：1.2U/ml 的 dispase Ⅱ
7.消化液 2：0.25% 胰蛋白酶+0.02mM EDTA
8.消化液 3：0.1%Ⅰ 型膠原酶
9.75% 醫(yī)用酒精
10.胎牛血清（FBS）

實驗器械：
1.培養(yǎng)皿
2.T-25 細胞培養(yǎng)瓶
3.100 目不銹鋼網篩
4.200 目不銹鋼網篩
5.眼科剪
6.眼科鑷
7.離心管（15ml、50ml）

實驗步驟：
1.新鮮的bao皮組織，裝盛于含有無菌生理鹽水或 1×PBS 的無菌容器中，于保溫盒中，冰上放置離體 6h 內運輸到實驗室進行后續(xù)分離。
2.在無菌環(huán)境中取出bao皮組織，用 1×PBS 清洗 2-3 次去除表面血液后，75% 的酒精浸泡 100s
3.酒精浸泡組織后快速將組織轉入裝有 1×PBS 的培養(yǎng)皿中震蕩清洗數次以去除酒精，然后用眼科剪小心剪去皮下組織（脂肪，微血管等）
4.將去除了脂肪和微血管組織的再用 1×PBS 清洗幾次后，剪成 3mm*8mm 左右的皮片，用消化液 1  4 度消化過夜（15-18h）。
5.第二天，用 2 個眼科鑷子小心撕開過夜消化的皮膚組織，分離和表皮；
6.分離的表皮用眼科剪剪碎后用消化液 3 37 度水浴消化1h。
7.消化完成后用移液器充分吹打 100 次左右，然后用含血清的培養(yǎng)基終止消化，過 200 目不銹鋼網篩后取濾懸液，轉入 15ml 離心管中，400g 離心 10 分鐘，離心完成后棄去上清，沉淀用 3ml 的 1×PBS 吹打重懸后，400g 離心 5min 離心完成后棄去上清，沉淀用 2ml 的原代角質細胞培養(yǎng)基吹打重懸后，轉入已經裝有 2ml 培養(yǎng)基的 T-25 培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于 37℃ 的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
8.視細胞貼壁情況 48-72h 后換液去除未貼壁的細胞，之后繼續(xù)培養(yǎng)，視細胞生長狀況和培養(yǎng)基顏色每 2-3d 換液一次；待細胞貼壁率達到 80-90% 后，進行常規(guī)傳代擴增操作（角質細胞對胰酶不太敏感，消化時間可能會增加到 10-15 分鐘，有時需要配合使用無菌細胞刮鏟進行傳代）。