在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大家是不是總會(huì)好奇別人家的實(shí)驗(yàn)總是做的又快又好，而自己做的實(shí)驗(yàn)又慢又難得做出自己滿意的結(jié)果，搞得一天到晚也挺忙的，心想：我也很努力很認(rèn)真啊，為啥效率總提不起來(lái)呢？
其實(shí)，有時(shí)候并不是自己不努力，只是沒有找對(duì)方法。做實(shí)驗(yàn)可不能光是埋頭苦干，還要學(xué)會(huì)運(yùn)用合適的檢測(cè)試劑盒，這樣就能事半功倍。
如果你還在用 MTT，那就真的 OUT 了，MTT 花 4 小時(shí)才能得到的結(jié)果用 CCK-8 只需 1 小時(shí)，CCK-8 可用于細(xì)胞增殖和毒性分析，同 MTT 法相比，CCK-8 即開即用，檢測(cè)時(shí)間大概在 1 小時(shí)左右。
不僅如此，CCK-8 對(duì)細(xì)胞的毒性極小，*可以測(cè)完細(xì)胞增殖或藥物毒性后再繼續(xù)用細(xì)胞進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。下面小編就來(lái)為大家介紹一下 CCK-8 的具體情況。
CCK-8 基本原理
基本原理為：該試劑中含有 WST-8【化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2 H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體 1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。
圖 1. WST-8 檢測(cè)原理圖 EC=electron coupling reagent，即電子耦合試劑)
圖 2. CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活性原理圖
產(chǎn)品用途
主要用于藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)。
細(xì)胞毒性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)對(duì)比
表 1. 細(xì)胞毒性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)對(duì)比
CCK-8 的實(shí)驗(yàn)方法與步驟
☆實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞活性檢測(cè)
1. 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96 孔板每孔加入 100 μL， 使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至 （1,000~10,000）/ 孔。
2. 5% CO2，37℃ 培養(yǎng)細(xì)胞 24 小時(shí)（培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而異）。
3. 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。如果起始的培養(yǎng)體積為 200 μL，則需加入 20 μL CCK-8 溶液，其它情況以此類推。
4. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 0.5~4 小時(shí)，對(duì)于大多數(shù)情況孵育 1 小時(shí)就可以了。時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定（一般情況下，白細(xì)胞較難顯色，因此需要較長(zhǎng)的 CCK-8 反應(yīng)時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量。懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難顯色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，CCK-8 的培養(yǎng)時(shí)間一般為 1~4 小時(shí)，注意：CCK-8 的jia反應(yīng)時(shí)間以具體顯色的jia時(shí)間為準(zhǔn)）。初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在 0.5、1、2 和 4 小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測(cè)，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
5. 在 450 nm 測(cè)定吸光度。
☆ 實(shí)驗(yàn)二： 細(xì)胞增殖 - 毒性檢測(cè)
1. 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96 孔板每孔加入 100 μL， 使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至 （1,000~10,000）/ 孔。
2. 5% CO2，37℃ 培養(yǎng)細(xì)胞 24 小時(shí)（培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而異）。
3. 加入 10 μL 不同濃度的待測(cè)物質(zhì)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間 （例如 6、12、24 或 48 小時(shí)）。
4. 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。如果起始的培養(yǎng)體積為 200 μL，則需加入 20 μL CCK-8 溶液，其它情況以此類推。
5. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 0.5~4 小時(shí)，對(duì)于大多數(shù)情況孵育 1 小時(shí)就可以了。時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定（一般情況下，白細(xì)胞較難顯色，因此需要較長(zhǎng)的 CCK-8 反應(yīng)時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量。懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難顯色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，CCK-8 的培養(yǎng)時(shí)間一般為 1~4 小時(shí)，注意：CCK-8 的jia反應(yīng)時(shí)間以具體顯色的jia時(shí)間為準(zhǔn)）。初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在 0.5、1、2 和 4 小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測(cè)，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
6. 在 450 nm 測(cè)定吸光度。
圖 3. 實(shí)驗(yàn)操作示意圖
☆ 注意事項(xiàng)：
如果待測(cè)物質(zhì)有氧化還原性，可在加 CCK-8 之前更換新鮮的培養(yǎng)基，去掉待測(cè)物質(zhì)的影響。
☆ 計(jì)算公式：
細(xì)胞存活率 = [（實(shí)驗(yàn)孔 — 空白孔）/ （對(duì)照孔 — 空白孔）] × 100%
抑制率 = [（對(duì)照孔 — 實(shí)驗(yàn)孔） / （對(duì)照孔 — 空白孔）] × 100%
實(shí)驗(yàn)孔 （含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測(cè)物質(zhì)）
對(duì)照孔 （含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒有待測(cè)物質(zhì)）
空白孔 （不含細(xì)胞和待測(cè)物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8）
注意事項(xiàng)
1. 次做實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。
2. 接種時(shí)注意細(xì)胞懸液一定要混勻，以避免細(xì)胞沉淀下來(lái)，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不一致。
3. 培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)液容易揮發(fā)，為減少誤差，建議培養(yǎng)板周圍的四邊每孔只加培養(yǎng)基。
4. 建議采用多通道移液器，減少平行孔間的誤差，加 CCK-8 時(shí)，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基液面下加，容易產(chǎn)生氣泡，干擾 OD 值。
5. 若細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色或 pH 發(fā)生變化，建議更換培養(yǎng)基后再加 CCK-8，含有酚紅的培養(yǎng)基不影響測(cè)定。
6. CCK-8 對(duì)細(xì)胞的毒性非常低，其他的實(shí)驗(yàn)，例如中性紅法或結(jié)晶紫法 ，也可在 CCK-8 法檢測(cè)完后繼續(xù)進(jìn)行。
7. 可以使用大于 600 nm 的波長(zhǎng)，例如 650 nm，作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定，CCK-8 在參比波長(zhǎng)處沒有吸光值，設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是為了去除由于樣品渾濁所帶來(lái)的吸收。
8. 如果實(shí)驗(yàn)中待測(cè)物質(zhì)有氧化還原劑，在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入藥物，然后加入 CCK-8 試劑在一定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)，和不加藥物的培養(yǎng)基進(jìn)行比較 （只加 CCK-8 試劑），如果 OD 值明顯偏高，則說(shuō)明有反應(yīng)。
9. 加 CCK-8 試劑時(shí)速度要快，減少試劑在移液器上的殘留，加入 CCK-8 試劑后輕輕震培養(yǎng)板，為了避免加樣時(shí)由于 CCK-8 殘留在槍頭上所帶來(lái)的誤差，可以在加樣前用培養(yǎng)稀釋 CCK-8 試劑并混勻后加樣。
10. CCK-8 反復(fù)凍融會(huì)增加背景值，干擾實(shí)驗(yàn)測(cè)定。
CCK-8 常見問題解答
☆ CCK 的保存和穩(wěn)定性如何？
答：CCK 穩(wěn)定性高，避光條件 -20℃ 有效期 2 年，4℃ 有效期 1 年。經(jīng)常使用建議 4℃ 保存，避免反復(fù)凍融。CCK 正常顏色為粉紅色，若顏色發(fā)生明顯偏差，質(zhì)量可能有發(fā)生變化。
☆ CCK 會(huì)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色嗎？
答：不會(huì)，首先 WST-8 不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞染色，整個(gè)顯色反應(yīng)都是在培養(yǎng)體系中進(jìn)行的。另外 WST 和 WST-8 甲臜都屬于高度水溶性組分，反應(yīng)結(jié)束更換新的培養(yǎng)液，即可清除外源組分。
☆在加入 CCK-8 時(shí)可否不更換培養(yǎng)基？
答：一般情況下可以不更換培養(yǎng)基。但是如果培養(yǎng)基里有氧化還原性物質(zhì)的話，有可能會(huì)產(chǎn)生誤差，必須更換其它培養(yǎng)基。
☆ 若是使用 6 孔或者 24 孔板進(jìn)行試驗(yàn)，CCK 試劑使用量怎么樣呢？
答：如果要使用 6 孔板或 24 孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK 溶液。
☆ 能否用 384 孔板進(jìn)行細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/strong>
答：可以，CCK-8 產(chǎn)品的使用量為每孔培養(yǎng)基總體積的 10%。建議先將 CCK-8 產(chǎn)品稀釋一倍，然后加入培養(yǎng)基總體積的 20% 即可，這樣可減少誤差。
☆ 只可以在 450 nm 波長(zhǎng)處測(cè) OD 值嗎？
答：可以在 450 nm 波長(zhǎng)處測(cè) OD 值，但是若無(wú)此波長(zhǎng)的濾光片，可選擇吸光度在 430~490 nm 之間的濾光片，但是 450 nm 濾光片的檢測(cè)靈敏度高。
☆ 若是暫不檢測(cè) OD 值，該如何處理？
答：若暫時(shí)不測(cè)定 OD 值，可以向每孔中加入 10μL0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24 小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化
☆ 在實(shí)驗(yàn)中 OD 值太高，怎么解決？
答：可以縮短加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時(shí)間。例如：可以把加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由 2 小時(shí)縮短為 1 小時(shí)。此外，可適當(dāng)減少細(xì)胞的數(shù)量。
☆ 如果 OD 值太低，怎么解決？
答：可以采取 2 個(gè)辦法：1、適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量；2、延長(zhǎng)加入 CCK-8 試劑后的反應(yīng)時(shí)間。
☆ 應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？
答：建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣。對(duì)于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
