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篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的兩種方法
點(diǎn)擊次數(shù):90 更新時(shí)間:2024-09-11

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系(穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株)指在細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)特定基因或干擾特定基因表達(dá)。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的目的基因質(zhì)粒DNA整合到細(xì)胞染色體上,使細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)該基因。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株包括多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。慢病毒感染目的細(xì)胞后,通過(guò)抗性基因篩選得到的細(xì)胞株是多個(gè)細(xì)胞克隆的組合。單克隆細(xì)胞株是從多克隆細(xì)胞中經(jīng)細(xì)胞克隆挑選得到的,由一個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增得到的細(xì)胞株。單克隆細(xì)胞株性狀統(tǒng)一,傳代過(guò)程中細(xì)胞的基因表達(dá)保持穩(wěn)定。

用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒或病毒侵染的方法將構(gòu)建好的含靶基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞,根據(jù)不同的基因載體中所含的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物進(jìn)行篩選混合陽(yáng)性克隆。在陽(yáng)性混合克隆的基礎(chǔ)上,得到單細(xì)胞長(zhǎng)出的陽(yáng)性單克隆,繼而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。常用的真核表達(dá)載體的抗性標(biāo)志物有嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)和新霉mei素(neomycin)。


篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的兩種方法


篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的兩種方法

1、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后,單克隆方法篩選穩(wěn)定細(xì)胞系

對(duì)大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低。對(duì)于基因過(guò)表達(dá),如果轉(zhuǎn)染效率達(dá)到40%,基因過(guò)表達(dá)尚可。但是對(duì)于基因干擾實(shí)驗(yàn),對(duì)轉(zhuǎn)染效率要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基因過(guò)表達(dá),通常質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無(wú)法滿足。

另外,質(zhì)粒游離于細(xì)胞質(zhì)中,很快降解,無(wú)法滿足較長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)項(xiàng)目;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合幾率極低,穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建耗時(shí)耗力,且得率很低,往往需要挑取單克隆株。

2、病毒感染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株

病毒感染方法較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選單克隆方法更方便和高效,是目前主流的穩(wěn)定細(xì)胞系篩選方法。用慢病毒制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,由于其高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達(dá)、宿主范圍廣,感染效率高,且與細(xì)胞染色體整合而不發(fā)生基因重排,是制備穩(wěn)定細(xì)胞株的理想載體。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株服務(wù)流程

1、載體構(gòu)建:將外源基因構(gòu)建到合適的載體上,如需病毒轉(zhuǎn)染,則包裝病毒。

2、篩選濃度測(cè)定:以 10-14 天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度。

3、細(xì)胞接種:轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞,各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達(dá)到 60%-80% 覆蓋。

4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染:用構(gòu)建好的載體(或包裝好的病毒)轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。

5、抗生素篩選。

6、鑒定篩選結(jié)果。

終交付

1、病毒滴度檢測(cè)報(bào)告;穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株;

2、結(jié)題報(bào)告,包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)流程,測(cè)序結(jié)果和峰圖、引物序列、載體圖譜和滴度測(cè)定報(bào)告和q-P


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